Czym  jest stres oksydacyjny?

Chciałbym napisać dziś parę słów na temat, czym jest stres oksydacyjny i czym się różni od potocznie rozumianego stresu?

Otóż są to kompletnie różne pojęcia. Tak jak koń i koniak. Jedynie podobnie brzmią. Jedyny punkt łączący te pojęcia jest taki, że zwykły stres w pewnym,  nie aż tak dużym stopniu zwiększa poziom stresu oksydacyjnego w komórce.

Stres oksydacyjny to pojęcie ściśle związane z procesami produkcji energii w komórce. Jest wręcz jego częścią, integralnym elementem. Nie ma produkcji energii bez towarzyszącego mu stresu oksydacyjnego. Jest on też ściśle związany z cząsteczką tlenu, gdyż to właśnie wolne rodniki tlenowe są głównymi nośnikami stresu oksydacyjnego w komórce. Tlen występuje jako cząsteczka O₂. Reakcja spalania z udziałem tlenu wygląda w organizmie następująco:

0₂  +   4e^-    ->   O₂^(4-)

Następnie O₂^4- bardzo szybko przyłącza pływające sobie w cytoplazmie mitochondriów  4 protony H+:

O₂ ^4- + 4H⁽⁺⁾  ->  2 H₂0

Zauważmy, że aby spalanie przebiegało prawidłowo, 4 elektrony muszą trafić równocześnie (w jednym momencie) na cząsteczkę tlenu i całkowicie ją zredukować, w przeciwnym razie powstanie jakiś nie w pełni zredukowany wolny rodnik tlenowy.

Następne pojęcie to wodór: H₂. Wodór jest ekstrahowany z cukrów tłuszczy i białek na cele spalenia, czyli wytworzenia energii. Wrzucany jest następnie na łańcuch 4 skomplikowanych kompleksów białkowych zwanych łańcuchem cytochromów. Kompleksy te pływają sobie w wewnętrznej błonie mitochondriów - czyli struktur produkujących energię w komórce. W obrębie tego łańcucha następuje rozdzielenie wodoru na dodatnie protony (H⁺) i ujemne elektrony (e^-). Protony są wyrzucane na jedną stronę błony mitochondrialnej, a elektrony na drugą. Następuje rozdzielenie ładunków elektrycznych, co wymaga energii. Energia chemiczna wodoru zostaje tymczasowo zamieniona na energię elektryczną - napięcia w poprzek błony mitochondrialnej. Napięcie to wynosi w warunkach prawidłowych ok. 140mV (miliwoltów). O roli wartości tego napięcia dla równowagi i prawidłowości procesów biochemicznych w komórce napisano już setki artykułów. Na ten moment zapamiętajmy, że to arcyważny element równowagi biochemicznej  w komórce.

Na końcu łańcucha cytochromów w mitochondriach (fabrykach energii) 4 elektrony są synchronicznie przenoszone na tlen.

Niestety zdarza się, że elektrony wysmykną się z łańcucha, "uciekną przez dziurki" i trafiają jako pojedyncze elektrony na tlen pływający sobie w okolicy.

e^- + O₂  ->  O₂^-

Powstaje rodnik nadtlenkowy ( ang:  superoxide radical), podstawowy rodnik stresu oksydacyjnego.

Trzeba dodać, że zgodnie z prawami fizyki kwantowej, tlen może sobie być nawet w pewnej odległości od cytochromów a elektron i tak sobie przeskoczy, gdyż jako fala materii może przeskoczyć nawet na większą odległość przenikając przez inne cząsteczki znajdujące się po drodze. Innymi słowy, nie da się procesu ucieczki elektronów zredukować do zera. Majstersztyk ewolucji polega na tym, że proces ten został zminimalizowany do ok. 0.1 - 0.5%. Jednak bardzo niewiele potrzeba, by proces ten znacząco się zwiększył, generując nadmiarowy stres oksydacyjny mitochondrialny.

Ile rodników nadtlenkowych O₂^- powstaje w ludzkim organizmie w mitochondriach?

Przyjmijmy, że podstawowa przemiana materii w organizmie to ok. 2000kcal = 8200kJ. Można przeliczyć, że do wytworzenia tej ilości energii potrzeba ok. 0.5 kg tlenu na dobę.

Z tego 0.1-0.5%,  czyli 0.5-2.5 grama to powstające rodniki O₂^- . Niby nie dużo. Jednak jeśli potraktujemy tę cząsteczkę jak silny żrący kwas wypalający nas od środka, to nie jest to już tak mało. W trakcie wysiłku fizycznego, gdy przemiana materii rośnie, wartość ta również rośnie, choć najnowsze badania sugerują, że nie aż tak samo szybko jak rośnie produkcja energii.

Co się dzieje z rodnikiem nadtlenkowym O₂^- ?

Skoro rodnik ten jest taki groźny, to trzeba go szybko z komórki usunąć. Robi to enzym dysmutaza nadtlenkowa mitochondrialna (superoxide dysmutase, SOD2) - pierwsza linia obrony przed stresem oksydacyjnym. Jest to jeden z najbardziej wydajnych i ważnych enzymów w komórce. Brak tego enzymu powoduje, że zarodek ginie we wczesnych stadiach rozwoju zarodkowego. Wyłapuje on 2 cząsteczki O₂^- i zamienia na 1 cząsteczkę mniej groźnego rodnika, bardziej stabilną : wodę utlenioną.

2 O₂^-  -> O₂ + O₂^(2-)

Ten drugi tlen szybko przyłącza pływające sobie w cytoplazmie protony:

O₂^(2-)  +  2H⁺  -> H₂O₂

( protony  H+ i jony OH- to stabilne cząsteczki, naturalnie występujące w wodzie jako produkt spontanicznej hydrolizy wody, decydują o jej kwasowości lub zasadowości .  Różne rodniki zawsze mogą sobie przyłączyć lub odłączyć H+/OH-, jeśli powstała cząsteczka jest bardziej stabilna, jednak jest to dalej jakby ten sam wolny rodnik. Czyli przykładowo O₂^2- i H₂O₂ to ten sam wolny rodnik, tylko H₂O₂ jest bardziej stabilna)

SOD2 potrzebuje do swojego działania manganu dwuwartościowego. Mn²⁺. Z tego powodu mangan jest jednym z najważniejszych pierwiastków śladowych w organizmie.

Co się dzieje z wodą utlenioną w komórce?

Woda utleniona jest rozkładana przez inne enzymy. W międzyczasie wydostaje się częściowo z mitochondriów do cytoplazmy komórki "informując" jądro komórkowe i różne inne białka w cytoplazmie, jaka jest intensywność procesu produkcji energii i towarzyszącego stresu oksydacyjnego w mitochondriach. Stężenie wody utlenionej w komórkach jest więc bardzo ważnym elementem równowagi procesów biochemicznych, nie może być ani za duże, ani za małe. Owe inne enzymy rozkładające wodę utlenioną to katalaza, peroksydaza glutationowa. Również różne antyoksydanty wyłapują elektrony z  O₂^- i H₂O₂ np. witamina C.

Wszystko jest dobrze, gdy stres oksydacyjny kończy się na tym etapie. Niestety, gdy poziom stresu oksydacyjnego (stężenie O₂^- i H2O2) wzrasta w skutek różnych zjawisk, może dojść do niebezpiecznego zjawiska - rekacji Fentona.

Co to jest Reakcja Fentona?

W jej przebiegu powyższe rodniki, bazując na atomach żelaza lub miedzi są zamieniane na bardzo groźny rodnik hydroksylowy: OH. Rodnik ten jest tak na prawdę formą tlenu, który przyłączył 3 z 4 elektronów:

3e^- + O₂  ->  O₂^(3-)

O₂^(3-) +2H⁺  -> OH^-   +  OH

lub inaczej patrząc: wodą utlenioną, która przyłączyła trzeci elektron:

H₂O₂  +  1e^-  -> OH^- +  OH

Rodnik ten żyje bardzo krótko (1 nanosekunda = 10^(^-9)s), tak że nie ma szans, by jakiś enzym zdążył go złapać, zanim ten nie uczyni w komórce jakiejś szkody. Trzeba dodać, że żelazo/miedź się w tej reakcji nie zużywają, ot po prostu przekształcają jedne rodniki w inne przenosząc elektrony pomiędzy nimi. O ile woda utleniona i O₂^- miałyby bez reakcji Fentona dużą szansę zostać rozłożone przez enzymy, po zamianie na OH już tej szansy nie mają.

Tak więc ewolucja nawet nie wytworzyła żadnego enzymu do jego usuwania. Rodnik ten powstaje w dużych ilościach np. w czasie ostrego niedotlenienia komórki (zawał serca, udar mózgu, zatrucia toksynami zaburzającymi pracę cytochromów). Mogą go w jakiejś mierze usuwać jedynie antyoksydanty, którym uda się przeniknąć do mitochondriów.

Toksyny cytochromowe

Jak pisałem, łańcuch cytochromów to majstersztyk ewolucji.  każdy z 4 kompleksów to konglomerat kilku - kilkunastu białek, nawet niewielkie zaburzenie ich struktury sprawia, że przepływ elektronów staje się zaburzony i więcej elektronów zaczyna wyciekać. Każda cząsteczka, która przylepia się do cytochromów jest więc silną toksyną stresooksydacyjną. Taką cząsteczką są m. in. wspomniane w nr 4 antybiotyki fluorochinolony, które mają bardzo podobną strukturę do chinonów budujących również łańcuch cytochromów.  Jako że kumulują się one w tkankach, działają nawet wiele miesięcy i lat po zażyciu antybiotyku podnosząc poziom stresu oksydacyjnego i obniżając witalność.

W przypadku utrzymującego się nadmiernego wycieku elektronów dochodzi do ich powolnego, niszczycielskiego działania na DNA mitochondriów (matrycę przechowującą kod genetyczny), które jest bardzo wrażliwe na uszkodzenia. Skutek - niektóre w białka budujące cytochromy zaczynają być budowane w sposób błędny, mają ciut nieprawidłową strukturę, co sprawia, że majstersztyk ewolucji nie jest już tak idealny. Wyciek elektronów narasta. Błędne koło uszkadzania komórek się nakręca...

Komórka broni się przed tym w ten sposób, że bardziej uszkodzone mitochondria są usuwane a zdrowe /mniej uszkodzone się rozmnażają. Jednak przy masywnych uszkodzeniach ten proces może być niewystarczający.

Generalnie mówiąc - uszkodzenia DNA mitochondrialnego to jeden z naturalnie występujących aspektów procesu starzenia się organizmu.

Cząsteczką przenoszącą wodór pomiędzy cytochromami jest ubichinon czyli tzw. koenzym Q10. Jego niedobór jest również czynnikiem nasilającym stres oksydacyjny. Jego naturalna synteza słabnie z wiekiem oraz w skutek zażywania tzw. statyn, czyli leków hamujących syntezę cholesterolu.

Inny aspekt wycieku elektronów to niedobór żelaza. Cytochrom III i IV zawierają w swojej strukturze grupę hemową z żelazem. W przypadku niedoboru żelaza cytochromy mają w tym miejscu dziurę. A przez dziurę wyciekają elektrony.

Oksydazy NADPH - drugie główne źródło stresu oksydacyjnego

Grupa enzymów 7 zwanych oksydazami NADPH - w skrócie molekularnym - NOX - to enzymy które świadomie produkują wodę utlenioną w różnych celach. Najczęściej, głównie, w celu zabijania patogenów wewnątrzkomórkowych tą wodą utlenioną. Ponieważ woda utleniona jest substancją żrącą, ich aktywacja podlega licznej skomplikowanej regulacji przez bardzo wiele czynników. Jest to grupa enzymów, która jest bardzo ważna dla całokształtu równowagi wewnątrzkomórkowej. Generalnie w dużym skrócie - wzrost aktywności tych enzymów obserwuje się we wszystkich przewlekłych stanach zapalnych. Ich aktywność jest w dodatnich sprzężeniach zwrotnych z systemem cytokin prozapalnych. Więc stan zapalny aktywuje NOX-y, NOX-y aktywują stan zapalny. Dzięki temu stan zapalny może się wzbudzić z prawie zerowego poziomu w stanie zdrowia do bardzo wysokiego w stanie choroby i zwalczania patogenów. Ta spirala wzajemnej aktywacji rosłaby do nieskończoności i rozpuszczenia całej komórki, gdyby nie 2 układy, które hamują tę spiralę. Są to autofagia i Nrf2. W COVID-zie oba te układy są osłabione i to jest główna przyczyna ciężkości przebiegu COVID-u i rozwijania się stanu hiper-zapalnego. Dla biologów molekularnych są to rzeczy oczywiste.

Trzeba jeszcze dodać, że sprzężenia zwrotne dodatnie NOX-ów dotyczą nie tylko układu cytokin ale również stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego ( patrz artykuł o ekscytotoksyczności neuronów). NOX-y podnoszą poziom wapnia w komórce, podwyższony poziom wapnia aktywuje NOX-y.

Trzeba jeszcze dodać, że podwyższony poziom wapnia aktywuje układ cytokin prozapalnych a cytokiny podnoszą poziom wapnia a jedne i drugie aktywują NOX-y.

 Trzeba jeszcze dodać, że NOX-y aktywują enzym NOS (nitric oxide synthase) który produkuje tlenku azotu NO - inną cząsteczkę wykorzystywaną do zabijania patogenów, a tlenek azotu aktywuje NOX-y do produkcji H₂O₂.

Trzeb jeszcze dodać, że NOX-y aktywują czynnik transkypcyjny HIF-1a będący formą adaptacji do warunków niedoboru tlenu i ochrony mitochondriów, a HIF-1a aktywuje cytokiny i podnosi poziom wapnia i aktywuje NOX-y oczywiście.

Czy trzeba coś jeszcze dodawać, by uzmysłowić jak ważna jest regulacja aktywności NOX-ów.

Na szczęście woda utleniona produkowana przez NOX-y aktywuje czynnik transkrypcyjny Nrf2, który aktywuje produkcję enzymów usuwających wszystkie wolne rodniki, więc Nrf2 obniża poziom stresu oksydacyjnego. Jako efekt końcowy wytwarza się więc rodzaj dynamicznej równowagi H₂O₂ z poziomem  stresu oksydacyjnego, zapalnego i wapniowego dopasowanego w sposób przybliżony do chwilowych potrzeb komórki. Matematycy używają do opisania takich stanów równowagi układów równań różniczkowych. Niestety na medycynie studenci nie uczą takiej matematyki, więc pewnie jeszcze trochę zaczekamy, zanim zaczną rozumieć takie zjawiska regulacyjne nie tylko na poziomie opisu słownego ale również matematycznego...

Stres retikuloendoplazmatyczny

Dla formalności uzupełnię jeszcze informacje dotyczące stresu oksydacyjnego o jego komponent retikuloendoplazmatyczny. Ilościowo może nie jest to duży udział ale z pewnością istotny w określonej grupie chorób, w których ten rodzaj stresu ma miejsce. Otóż proces składania białka z nitki w kłębek zachodzi właśnie w reticulum. W trakcie tego procesu powstaje pewna ilość wody utlenionej w trakcie tworzenia tzw. mostków siarczkowych między aminokwasami zawierającymi siarkę, które stabilizują strukturę tego nowego białka. Tak więc ta woda utleniona musi być również rozłożona, w przeciwnym razie proces fałdowania może zachodzić nieprawidłowo, co rodzi poważne konsekwencje dla całej komórki. Jest to jednak proces co najwyżej pośrednio powiązany z pozostałymi rodzajami stresu oksydacyjnego.

 To tyle na dziś. Temat jest rozległy więc będę jeszcze do niego wracać w przyszłych numerach.

Pozdrawiam

Prof. UAM dr hab. Krzysztof Michalak